آزمایش MLPA چیست و چه کاربردی در تشخیص بیماری های ژنتیکی دارد؟

بیماری های ژنتیکی در انسان به دلیل بروز تغییر در ژن ها و توالی DNA ایجاد می گردد، این تغییرات یا جهش های ژنتیکی گاهی به صورت حذف یا مضاعف شدگی قسمتی از ژن می باشند که منجر به بروز ناهنجاری می شود. آزمایش MLPA بهترین و مطمئن ترین روش برای شناسایی این تغییرات و تشخیص بیماری است. اصول این روش بر مبنای تکنیک PCR است و قادر به تشخیص ناهنجاری هایی مانند دیستروفی عضلانی دوشن (DMD) و آتروفی عضلانی نخاعی (SMA) و آنیوپلوئیدی ها می باشد. در این روش از پروب های اختصاصی استفاده می شود که قادر است حدود 50 توالی مختلف را در یک واکنش PCR مورد بررسی قرار دهد، این موضوع از مزیت های منحصر به فرد آزمایش MLPA است.

تست MLPA چگونه انجام می شود؟

کیت های مورد استفاده در آزمایش MLPA دارای بیش از 40 پروب اختصاصی می باشند که پس از استخراج DNA از خون بیمار، در فرایند PCR مورد استفاده قرار می گیرند. هر یک از پروب های آزمایش MLPA مکمل توالی خاصی از DNA هدف است، از سوی دیگر در این تست از پروب های عمومی یا Universal نیز استفاده می شود. ویژگی پروب های اختصاصی MLPA، وجود توالی هایی به نام Stutter sequence است که امکان تکثیر قطعات مختلف با اندازه های گوناگون را فراهم می کند.

به طور کلی آزمایش MLPA در 6 مرحله انجام می شود که عبارتند از:

• Denaturation 

اولین مرحله دناتوراسیون است که دو رشته DNA الگو در دمای حدود 98 درجه از هم جدا شده و به صورت تک رشته ای در می آیند. 

• Hybridization

در مرحله هیبریداسیون پروب های اختصاصی به DNA تک رشته ای متصل می شوند. از آنجایی که MLPA به عنوان یکی از تکنیک های Multiplex PCR محسوب می شود، می توان به صورت همزمان 60 پروب اختصاصی را در یک واکنش بررسی نمود. این پروب ها دارای یک توالی آغازگر هستند که به پرایمرهای PCR متصل می شوند و در تمامی پروب ها یکسان است.

• Ligation

سومین مرحله از آزمایش MLPA لیگاسیون است که در آن از آنزیم خاصی به نام DNA لیگاز استفاده می شود. این آنزیم، توالی هدف و پروب را به هم متصل می کند. به دلیل اینکه لیگاز عملکرد بسیار اختصاصی دارد، چنانچه هرگونه عدم تطابق بین پروب و ناحیه هدف وجود داشته باشد، لیگاز قادر به اتصال پروب ها نخواهد بود و هیچ تکثیری طی PCR رخ نخواهد داد. در نتیجه، MLPA جهش‌های نقطه ‌ای خاص را هم شناسایی می کند و قادر به تفکیک ژن های کاذب از بقیه ژن ها نیز می باشد. 

• Amplification

مرحله تکثیر در حقیقت اصلی ترین مرحله واکنش های زنجیره ای پلیمراز (PCR) است. در این مرحله پرایمر ها ، آنزیم DNA پلیمراز و dNTPs اضافه می شود. لازم به توضیح است که پرایمر مورد استفاده در این مرحله با رنگ های فلورسنت نشان دار می گردد.

• Fragment Separation

پس از اتمام فرایند PCR در آزمایش MLPA، محصول واکنش به دستگاه ژنتیک آنالایزر منتقل می شود تا با تکنیک الکتروفورز اتوماتیک قطعات تکثیر شده بر اساس انداره از هم تفکیک گردند.  

• Data Analysis

نتایج به دست آمده از Fragment Sizing توسط نرم افزار های خاص (GeneMarker, Coffalyser) مورد تجزیه و تحلیل قرار می گیرد و در صورت وجود بیماری علت آن تشخیص داده می شود. نسبت ارتفاع و سطح زیرین منحنی ها در مقایسه با منحنی نمونه های کنترل نشان دهنده تعـداد نسخه های الگوهـا می باشد.Coffalyser برنامه‌ای بر پایه excel است و تمام مراحل نرمالیزاسیون داده‌ها و اصلاح داده‌های sloping را انجام می‌دهد. نرم افزار GeneMarker، نرم افزاری منحصر به فرد در تجزیه و تحلیل ژنوتیپ است که با ادغام فناوری ها سرعت، دقت و سهولت آنالیز را افزایش می دهد. 

انواع مختلف آزمایش MLPA چیست و چه کاربردهایی دارند؟

در حال حاضر با ایجاد مجموعه ای از تغییرات در کیت های آزمایش MLPA، قابلیت این روش افزایش یافته است. روش های RT-MLPA و MS-MLPA تکنیک هایی هستند که این تغییرات در آنها اعمال شده است.

• RT-MLPA

از این تکنیک برای تجزیه و تحلیل مولکول های mRNA استفاده می شود. از آنجایی که آنزیم لیگاز نمی تواند پروب ها را به RNA متصل کند، لازم است که از آنزیم رونوشت بردار معکوس برای رونویسی معکوس از RNA و به دست آوردن cDNA استفاده گردد. بقیه مراحل مانند MLPA استاندارد پیش می رود.

• MS-MLPA

از این تکنیک به منظور تشخیص متیلاسیون استفاده می شود چون این داده ها در خصوص متیلاسیون اطلاعات مهمی را در مورد ژن ارائه می دهند. در مرحله اول، نواحی پروموتر متیله نشان دهنده ژن خاموش هستند، یعنی از روی این ژن رونویسی انجام نمی شود و پروتئینی تولید نمی گردد. ژن های خاموش را می توان به عنوان ابزار تشخیصی مورد استفاده قرار داد. به عنوان مثال، خاموش شدن یک ژن سرکوب کننده تومور منجر به رشد کنترل نشده سلولی می شود که عامل سرطان است. دوم اینکه متیلاسیون در بحث ایمپرینتینگ ژنومی از اهمیت بالایی برخوردار است.

• Digital MLPA 

فناوری جدید تکنیک MLPA، با بهره گیری از پلتفرم های NGS، قادر به خوانش بیش از 1000 توالی DNA ژنومیک به صورت همزمان است و تعداد کپی های ژنی را به سادگی در یک واکنش بررسی می نماید. استفاده از این روش هزبنه ها را کاهش داده و در زمان نیز صرفه جویی می شود.

مزایای استفاده از آزمایش MLPA

 آزمایش MLPA تکنیکی بسیار حساس، دقیق با بازدهی بالاست که قادر است جهش های حذف، مضاعف شدگی، نقطه ای، SNP و آنیوپلوئیدی ها را تشخیص دهد. بنابراین، در مقایسه با روش های دیگر از دقت بالاتری در تشخیص جهش ها برخوردار است. در ادامه به مقایسه مزایای این روش نسبت به سایر تکنیک ها پرداخته شده است:

• در مقایسه با MLPA، روش Real-time PCR دارای حساسیت کمتری برای شناسایی تغییرات کوچک است و این امر در صورتی ممکن است که جایگاه حذف و یا مضاعف شدگی ها مشخص باشد.
• معمولا برای تشخیص جهش های نقطه ای که از روش های تعیین توالی DNA استفاده می شود، در حالی که این تکنیک ها قادربه شناسایی تغییرات تعداد نسخه ژنی در حد یک اگزون نیستند.
•  روش Southern blots حذف های تا چند کیلو باز را شناسایی می نماید، اما برای انجام آن به مقادیر زیادی DNA با غلظت بالا و پروب های رادیو اکتیو نیاز است. این موضوع بسیار زمان بر و پر هزینه می باشد.
• بر خلاف FISH، آزمایش MLPA می تواند تغییرات ژنی کوچک را نیز شناسایی کند.

با در نظر گرفتن مواردی که به آن اشاره شد، توجه به این نکته نیز حائز اهمیت است که آزمایش MLPA تکنیکی کاربردی در تشخیص جهش های حذفی یا مضاعف شدگی است، اما گاهی محدودیت های خاصی به همراه دارد که شامل:

• 1- حساسیت به وجود برخی ناخالصی ها و آلودگی ها در اجزای واکنش: بنابراین انجام آزمایش نیاز به دقت بالایی دارد. 
• 2- برخی پلی مورفیسم های نادر و یا جهش ها، ممکن است موجب تضعیف سیگنال دریافتی شود و در نتیجه به منظور اطمینان بهتر است صحت نتایج با استفاده از روش دیگری به تایید برسد.

آزمایش MLPA چه بیماری هایی را تشخیص می دهد؟

• دیستروفی عضلانی دوشن

• دیستروفی عضلانی بکر

• آنیوپلوئیدی های جنین و تشخیص اختلالات کروموزومی پیش از تولد

• آلفا تالاسمی و بتا تالاسمی

• سندرم پرادر ویلی و آنجلمن

• هموفیلی

• آتروفی عضلانی نخاعی (SMA)

• برخی از سرطان ها مانند سرطان پستان

• شارکوت-ماری-توث (CMT)

• نوروپاتی ارثی (HNPP)

کاربرد آزمایش MLPA در تشخیص سرطان

امروزه آزمایش MLPA نقش مهمی در تشخیص بسیاری از سرطان ها دارد. سرطان های وراثتی به گروهی از سرطان ها گفته می شود که جهش های آنها در سلول های رده زایا ایجاد شده است و می تواند به نسل بعد منتقل گردد. سرطان سینه و سرطان تخمدان از شایع‌ترین سرطان هایی هستند که به روش MLPA و پروب های های اختصاصی برای ژن های BRCA1 و BRCA2 تشخیص داده می شوند.از دیگر سرطان های متداول می توان به پولیپوز آدنوماتوز خانوادگی (FAP) که به دلیل جهش‌های ژن APC و سرطان روده بزرگ غیر پولیپوز ارثی (HNPCC) (جهش در ژن های مسیر ترمیم mismatch) اشاره کرد. علاوه بر این کیت پروب های اختصاصی برای تشخیص انواع سرطان های ارثی، سرطان خون و سرطان پروستات نیز در دسترس است.

اهمیت آزمایش MLPA در تشخیص پیش از تولد چیست؟

تشخیص پیش از تولد، روشی است که با استفاده از نمونه برداری و کشت سلول های بدست آمده از پرزهای جفتی (CVS) یا مایع آمنیوتیک (AF) در دوران بارداری انجام می شود تا وضعیت سلامت جنین را مورد بررسی قرار دهد. در سال های اخیر استفاده از آزمایش MLPA برای غربالگری آنیوپلوئیدی کروموزوم های 13، 18، 21، X و Y به طور چشمگیری افزایش یافته است.

انجام این آزمایش نیاز به ناشتایی ندارد و با استفاده از خون گیری ساده انجام می شود. برای دریافت مشاوره رایگان و کسب اطلاعات بیشتر، میتوانید سوال خود را از طریق بخش گفتگوی آنلاین و ارتباط با مشتریان در قسمت پایین صفحه (لوگوی MOMGENE) مطرح نموده و یا با شماره تلفن 42500-021 داخلی 562 تماس حاصل فرمایید.