پرایمر یا آغازگر چیست و چه کاربردهایی در پزشکی و فن آوری های نوین دارد؟

پرایمر ها یا آغازگر، قطعات کوتاه (18 تا 24 باز) و تک رشته ای هستند که در بازدهی و موفقیت واکنش های زنجیره ای پلیمراز نقش کلیدی دارند. در هر واکنش PCR یک جفت پرایمر که اصطلاحا forward (پیشرو) و reverse (معکوس) نامیده می شود، مورد استفاده قرار می گیرد. در حین انجام واکنش، پرایمرها به توالی هدف متصل می شوند و در کنار آنزیم DNA پلیمراز سبب تکثیر ناحیه مورد نظر می گردند.در حقیقت پرایمرها تعیین کننده میزان اختصاصیت واکنش PCR می باشند. این توالی ها به گونه ای طراحی می شوند که مکمل ابتدا و انتهای توالی هدف در DNA باشند. ندازه محصولات PCR در حالت استاندارد بین 200 تا 1000 متغیر است و در واقع فاصله دو پرایمر از یکدیگر، اندازه محصول PCR را تعیین می کند. هرچند که در شرایط خاص ممکن است طول قطعه PCR چند ده جفت باز تا چندین هزار جفت باز باشد. مهم ترین مرحله پیش از سنتز پرایمر، طراحی آن است، که باید نکات خاصی را در این زمینه مد نظر قرار داد، این موارد شامل: 

طول پرایمر

یکی از عوامل بسیار مهم در موفقیت PCR، اندازه پرایمر ها می باشد، که بین 18 تا 24 نوکلئوتید متغیر است. هرچند که گاهی به علت محتوای GC در توالی، طول پرایمر ها ممکن است بیشتر از 30 و یا کمتر از 16 باشد. در هنگام طراحی پرایمر باید این نکته را در نظر داشت که افزایش سایز آغازگر سبب بالا رفتن زمان لازم برای اتصال پرایمر و آنزیم DNA پلیمراز به توالی هدف می گردد، و به این ترتیب مدت زمان واکنش PCR نیز افزایش خواهد یافت و ممکن است در انتهای واکنش آنزیم کارآرایی بهینه خود را از دست بدهد. در حالتی که اندازه پرایمر کمتر از حد استاندارد باشد، احتمال اتصال به نواحی غیراختصاصی افزایش خواهد یافت. علاوه بر در نظر گرفتن موارد فوق، تفاوت طول پرایمر forward و reverse نباید بیشتر از سه نوکلئوتید باشد.

دمای ذوب (Tm)

دمای ذوب پرایمر دمایی است که در آن نیمی از دو رشته DNA از هم جدا می شوند تا به صورت تک رشته ای درآیند. دمای ذوب پرایمر ها معمولاً بین 50 تا 60 درجه سانتیگراد است. البته اختلاف این دما در پرایمر forward و reverse نباید بیشتر از 3 درجه باشد، زیرا در این صورت واکنش PCR با مشکل مواجه خواهد شد. دمای Tm ارتباط مستقیمی با محتوای GC در توالی دارد. با افزایش سیتوزین و گوانین در توالی، Tm نیز بیشتر می گردد. نرم افزارهای طراحی پرایمر به صورت اتوماتیک دمای ذوب پرایمر را محاسبه می نمایند اما میتوان از فرمول زیر نیز برای محاسبه Tm استفاده نمود:

Tm = (4× (G + C) + 2×(A + T))

دمای اتصال پرایمر (Ta)

Ta دمایی است که در آن پرایمرها به DNA الگو متصل می شوند، دمای اتصال بهینه، اغلب به صورت تجربی و طی انجام واکنش PCR به دست می آید، اما به طور کلی، این دما حدود ۵ تا ۱۰ درجه سانتی‌گراد کمتر از دمای ذوب پرایمر (Tm) است. دمای اتصال از طریق فرمول زیر محاسبه می گردد:

Ta = 0.3 × (Tm of primer) + 0.7 × (Tm of product) – 14.9

لازم به توضیح است که پس از استفاده از نرم افزار برای طراحی پرایمر، بهتر است در هنگام انجام PCR دمای اتصال را با یک برنامه شیب دمایی (گرادیان) مورد بررسی قرار داد. در صورتی که Ta بیش از اندازه بالا باشد، اتصال به خوبی صورت نمی گیرد و بنابراین محصول PCR به اندازه کافی تکثیر نمی گردد. دمای پایین نیز سبب تشکیل ساختار های سنجاق سر و یا اتصال به نواحی غیر اختصاصی می شود.

توالی انتهای '3 پرایمر

این توالی ناحیه ای است که توسط آنزیم DNA پلیمراز طویل می گردد، بنابراین باید کاملا با توالی الگو منطبق باشد تا به صورت اختصاصی با آن جفت شود. وجود یک نوکلئوتید G یا C در انتهای'3، بازدهی PCR را افزایش می دهد. اما در صورتی که میزان آنها بیشتر از سه نوکلئوتید شود، سبب افزایش اتصالات غیر اختصاصی می شود. بنابراین باید از به وجود آمدن چنین حالتی اجتناب نمود و آن را در طراحی مد نظر قرار داد.

به طور کلی توالی های تکراری در پرایمر سبب ایجاد Primer Dimer و یا ساختارهای Hairpin (سنجاق سری) و حتی اتصال پرایمر به نواحی غیر اختصاصی می گردد. یکی از علت های تشکیل پرایمر دایمر مکمل بودن انتهای '3 با هم است در نتیجه بین پرایمر ها اتصال به وجود می آید و موجب عدم پاسخدهی واکنش PCR می شود. حتی ممکن است دایمر های تشکیل شده، طی واکنش PCR به عنوان الگو عمل کند و سبب تکثیر محصولات غیر اختصاصی شود. توالی آغازگر نباید در ساختار خود ناحیه ی مکمل هم داشته باشد، زیرا در این صورت حلقه یا Loop تشکیل می شود که به عنوان بازدارنده در واکنش PCR عمل می کند.

توالی انتهای '5 پرایمر

در مقایسه با توالی انتهای '3، توالی انتهای '5 از اهمیت کمتری برخوردار است، و به همین دلیل می توان با اهداف مختلف (نوترکیبی، کلونینگ، ژن درمانی و مهندسی ژنتیک) آن را دچار تغییر نمود. برای مثال یکی از تغییرات متداول ایجاد یک محل برش برای آنزیم های محدود الاثر است که در کلونینگ کاربرد دارد.

غلظت پرایمر

غلظت پرایمرهای مورد استفاده در PCR، به نوع واکنش بستگی دارد. زیرا نسبت پرایمر به DNA الگو ممکن است در واکنش های مختلف متفاوت باشد. باید این نکته را مد نظر داشت که غلظت بالای پرایمر در واکنش PCR سبب اتصال آغازگرها به نواحی غیر هدف و در نتیجه ایجاد محصولات غیر اختصاصی می گردد. چنانچه میزان پرایمر کمتر از حد طبیعی باشد نیز موجب عدم تکثیر قطعه مورد نظر می شود.

شرکت های سازنده پرایمر، معمولا آغازگرها را پس از سنتز به صورت پودر به سفارش دهندگان ارسال می نمایند. پرایمرها بعد از تحویل در آب یا محلول Tris-Hcl حل می شوند تا به غلظت 10 تا 100 پیکومول در میکرولیتر برسند. فرایند رقیق سازی پرایمرها باید با دقت فراوان و تحت شرایط کاملا استریل انجام شود، زیرا در صورت آلودگی پرایمر، این آلودگی به واکنش PCR نیز منتقل می شود و بنابراین موجب عدم موفقیت واکنش های زنجیره ای پلیمراز می گردد.

علاوه بر مواردی که در اینجا به آن اشاره گردید و به طور کلی در طراحی پرایمر باید مد نظر قرار گیرد، بر حسب نوع PCR و توالی هدف نیز، ممکن است پرایمرهای خاصی طراحی شوند که عبارتند از:

Real-Time PCR

اصول روش Real-Time بسیار مشابه PCR معمولی است، اما در این روش برای ارزیابی تکثیر محصول واکنش از رنگ های فلورسنت استفاده می شود. میزان نور ساطع شده حین انجام واکنش، نشان دهنده تکثیر محصول PCR در هر چرخه (سیکل) است. میزان حساسیت و اختصاصیت این روش بسیار بالاست و به دو نوع کمی (بررسی تعداد کپی) و کیفی (بررسی حضور و یا عدم حضور توالی مشخص) طبقه بندی می شود. علاوه بر این در طول انجام واکنش و پیش از اتمام آن می توان روند انجام واکنش را بررسی نمود، در حالی که در سایر روش های PCR این امکان وجود ندارد.

Multiplex PCR

روش Multiplex PCR قادر به تشخیص همزمان چندین توالی هدف با چند جفت پرایمر متفاوت است که این فرایند در یک واکنش منفرد انجام می شود. صرفه جویی در زمان و هزینه از مزیت های مهم این روش است. در زمان طراحی پرایمر باید این نکته را مد نظر داشت که Tm پرایمرها مشابه هم باشند، هم چنین اندازه ی محصولات PCR نیز باید به اندازه کافی متفاوت باشد تا در هنگام الکتروفورز به راحتی از هم تفکیک شده و قابل تشخیص باشند.

ARMS-PCR

این تکنیک مبتنی بر پرایمرهایی است که برای بررسی و تشخیص SNP یا چند شکلی تک نوکلئوتیدی مورد استفاده قرار می گیرند. در این روش، تنها زمانی که آلل هدف در نمونه وجود داشته باشد، فرایند تکثیر صورت می گیرد. پرایمرها به دو حالت نرمال و جهش یافته طراحی می گردند.

RT-PCR

اساس RT-PCR بر آنزیم نسخه بردار معکوس (DNA پلیمراز وابسته به RNA) و توانایی آن برای ساخت رشته DNA مکمل از روی mRNA الگو بنا شده است. این روش، تکنیکی دقیق برای بررسی بین ژن ها است.

Nested-PCR

واکنش Nested-PCR به گونه ای طراحی شده که اتصالات غیر اختصاصی در محصولات را به حداقل برساند و همچنین تکثیر قطعه هدف را نیز تقویت نماید. این تکنیک شامل دو واکنش PCR متوالی است، که در مرحله اول توالی DNA هدف تکثیر می گردد، و سپس محصول ایجاد شده در مرحله اول به عنوان الگو در نظر گرفته شده و با یک جفت پرایمر داخلی مجددا تکثیر و تقویت می شود. این موضوع سبب می شود میزان محصول اختصاصی افزایش یابد.

با در نظر گرفتن موارد فوق و بهره گیری از نرم افزار های طراحی پرایمر میتوان بر اساس نیاز، پرایمرهای مختلف را طراحی نمود.

خدمات طراحی و سنتز پرایمر

در این مقاله به توضیح نکات کلیدی و مهم در طراحی پرایمر پرداختیم، اما باید توجه داشت که پس از طراحی، پرایمر ها باید توسط نرم افزار های تخصصی بررسی شوند تا صحت آنها تایید گردد. لازم به توضیح است در مرکز مام ژن، علاوه بر ارائه کلیه خدمات ژنتیک و انجام آزمایش ها، طراحی و سنتز پرایمر نیز توسط کارشناسان در کمترین زمان ممکن و با بهترین کیفیت انجام می شود.

برای دریافت مشاوره رایگان و کسب اطلاعات بیشتر، میتوانید سوال خود را از طریق بخش گفتگوی آنلاین و ارتباط با مشتریان در قسمت پایین صفحه (لوگوی MOMGENE) مطرح نموده و یا با شماره تلفن 42500-021 داخلی 562 تماس حاصل فرمایید.