توالی یابی DNA چیست و انواع مختلف آن چه تفاوتی با هم دارند؟

توالی یابی DNA فرآیندی است که طی آن ترتیب قرارگیری نوکلئوتیدها در یک مولکول DNA مشخص می گردد. نتایج حاصل از توالی یابی حاوی اطلاعات مفیدی از ماهیت ژنتیکی افراد است. بنابراین توالی یابی DNA می تواند به نوبه خود به شناسایی تغییرات ژنتیکی که می تواند با ایجاد بیماری ژنتیکی مرتبط باشند، کمک کند. DNA یک ساختار مارپیچ دوگانه دارد که از چهار باز آلی تشکیل شده که همیشه به صورت جفت یکسان وجود دارند. نوکلئوتید آدنین (A) با تیمین (T) و نوکلئوتید سیتوزین (C) با گوانین(G) در ساختار DNA جفت می شوند. این جفت ها اساس مولکول های DNA و روش تکثیر و تقسیم سلول ها را تشکیل می دهند. ساختار جفت شدگی در روش های توالی یابی DNA از اهمیت بالایی برخوردار است. در دهه های اخیر پیشرفت های قابل توجهی در فناوری های موجود برای توالی یابی DNA صورت گرفته و روش های توالی یابی مبتنی بر رنگ های فلورسنت برای افزایش سهولت و سرعت تحقیق معرفی شدند. در ادامه این مطلب به معرفی انواع روش های توالی یابی می پردازیم.

روش های توالی یابی نسل اول

فناوری ‌های توالی ‌یابی نسل اول، که در دهه 1970 توسط زیست شناسان مولکولی ابداع شدند، شامل روش ماکسام گیلبرت و روش سنگر می باشند.

توالی یابی به روش سنگر

توالی یابی به روش سنگر نوعی روش خوانش است که بر پایه استفاده از نوعی نوکلئوتیدهای دی دئوکسی و ختم زنجیره می باشد. این روش برای تعیین توالی بازهای نوکلئوتیدی در یک قطعه DNA که معمولاً کمتر از 1000 جفت باز است، طراحی شده است. از توالی یابی به روش سنگر در پروژه ژنوم انسان برای تعیین توالی نواحی نسبتاً کوچک DNA انسان (900 جفت باز یا کمتر) و در نهایت مشخص کردن توالی ژن های موجود روی کروموزوم ها استفاده گردید. از جمله موادی در این تکنیک به کار می روند می توان به موارد زیر اشاره نمود:

• استفاده از یک پرایمر جهت آغاز سنتز

• آنزیم DNA پلیمراز برای سنتز رشته

• استفاده از 4 نوع دی دئوکسی نوکلئوتید تری فسفات که با رنگ فلوئورسنت نشاندار شده اند

در روند توالی یابی به روش سنگر، غلظت دی دئوکسی نوکلئوتید ها (ddATP، ddTTP، ddCTP، ddGTP) بسیار کمتر نوکلئوتیدهای نرمال است. این نوع نوکلئوتید ها به دلیل نداشتن گروه هیدروکسیل (OH) در ناحیه 3 پریم مانع از ادامه سنتز رشته DNA خواهند شد به همین دلیل نام دیگر روش سنگر، ختم زنجیره می باشد. در گذشته پس از اتمام توالی یابی، نمونه ها روی ژل مورد بررسی قرار می گرفت تا با توجه به اندازه های متفاوت و تفکیک بر این اساس آنالیز شوند. اما امروزه با کمک نوعی روش اتوماتیک و الکتروفورز موئینه این خوانش انجام می شود. به طوری که رشته های کوتاه سریع تر از لوله موئینه خارج شده و با تابش نور لیزر قابل مشاهده می گردند. به این ترتیب با کمک سیگنال های نوری متفاوتی که دریافت می شود می توان توالی DNA را شناسایی نمود.

توالی یابی به روش ماکسام گیلبرت

تفاوت اصلی بین توالی یابی به روش ماکسام گیلبرت و سنگر در این است که در توالی یابی به روش ماکسام گیلبرت Maxam-Gilbert اساس تعیین توالی DNA بر مبنای برش DNA و تولید قطعات مختلف می باشد. نام دیگر این روش، توالی یابی شیمیایی است و نیازی به سنتز قطعات DNA ندارد. اما از سوی دیگر، توالی یابی به روش سنگر روش خاتمه زنجیره ای است، که با ترکیب دی دئوکسی نوکلئوتیدها در توالی، طول توالی های DNA را قطع می کند. این روش از 4 مرحله مختلف تشکیل شده است که عبارتند از:

• در مرحله اول به انتهای 5՜ در DNA دو رشته ای، با کمک آنزیم کیناز نوعی فسفات رادیواکتیو P32 اضافه می شود.

• در مرحله دوم چهار تیمار شیمیایی برای بازهای A+G,G,C+T,C انجام می شود که شامل، دپورین کردن پورین ها A+G توسط اسید فرمیک، متیلاسیون گوانین(G) توسط دی متیل سولفات، هیدرولیز کردن پیریمیدین ها(C+T) توسط هیدرازین، و مهار واکنش هیدرازین برای تیمین با افزودن کلرید سدیم و هیدرولیز کردن سیتوزین به تنهایی می باشد.

• در مرحله بعد با از حرارت دهی، DNA دو رشته ای را تبدیل به DNA تک رشته ای می کنند.

• برش توالی DNA با استفاده از ماده هات پیپریدین (hot piperidine) که ساختار شیمیایی آن (CH2)5NH است، انجام می شود. به این صورت که توالی را در نواحی که بازهای آن تغییر پیدا کرده اند برش می دهد و در نهایت مجموعه ای از قطعات نشاندار شده که یک انتهای لیبل شده با فسفات رادیو اکتیو دارند، تولید می شود.

• جداسازی قطعات با الکتروفورز روی ژل انجام می شود و به این ترتیب توالی خوانش خواهد شد.

به طور کلی، از ویژگی های اصلی توالی یابی DNA به روش ماکسام گیلبرت می توان به حساسیت و اختصاصیت آن اشاره نمود، اما مشکل اینجاست که برای توالی یابی قطعه ای با اندازه حدود 200 تا 300 باز به چند روز زمان نیاز دارد و از سوی دیگر از عناصر رادیواکتیو و هم هیدرازین که یک نوروتوکسین در آن استفاده می شود که خطرناک می باشد.

روش توالی یابی ایلومینا

 روش توالی یابی ایلومینا، نوعی روش توالی یابی همزمان با سنتز (sequencing by synthesis) است که از روش های توالی یابی نسل دوم یا NGS است. در روش های توالی یابی نسل دوم از جمله ایلومینا، قبل از شروع توالی یابی، واکنش PCR انجام می شود تا سرعت و بازدهی توالی یابی افزایش یابد. در روش توالی یابی ایلومینا از توالی های آداپتور خاصی استفاده می شود که بر روی ذرات سیلیسی تثبیت یا فیکس شده اند و این ذرات درون چاهک هایی قرار دارند. مراحل اصلی توالی یابی نسل دوم عبارتند از:

• در مرحله اول DNA به طور تصادفی برش داده می شود و به دو انتهای آن توالی های سنتزی به نام لینکر متصل خواهد شد.

• در مرحله بعد، این نمونه آماده شده بر روی ذرات سیلیسی ریخته شده و قطعه از DNA به توالی مکمل خود که بر روی یکی از این ذرات قرار دارد متصل خواهد شد.

• در مرحله بعد از طریق فرآیند Bridge amplification این توالی ها تکثیر پیدا می کنند سپس چیپ (Chip) شسته می شود تا پرایمر ها و سایر مواد باقی مانده حذف شوند.

• پس از اتمام تکثیر قطعات، DNA دناتوره می شود تا به حالت تک رشته در آید.

تکنیک ایلومینا

مانند روش توالی یابی سنگر، بر اساس خاتمه سنتز عمل می کند با این تفاوت که این خاتمه برگشت پذیر می باشد. پس از اتمام تکثیر قطعات DNA از یکسری پرایمرها که مکمل بخش خاصی از نمونه و نوکلئوتیدهای نشان دار جهت توالی یابی قطعات استفاده می شود. نوکلئوتید هایی که در روش توالی یابی ایلومینا مورد استفاده قرار می گیرند، دارای نوعی رنگ خاص هستند که زمانی که در توالی DNA در زمان سنتز قرار می گیرند، رنگشان ثبت می گردد.