توالی یابی یا تعیین توالی DNA چیست و چگونه انجام می شود ؟

توالی یابی DNA، روشی است که ترتیب قرارگیری نوکلئوتیدها یا بازهای آلی در یک مولکول DNA را شناسایی می کند. DNA یا دئوکسی نوکلئوتید اسید، ماده وراثتی در سلول های بدن انسان ها و سایر موجودات است که در اندامکی به نام هسته سلول قرار گرفته اند. البته باید توجه داشت که بخشی از ژنوم نیز در سیتوپلاسم و در اندامکی به نام میتوکندری قرار دارد که به آن DNA میتوکنریایی گفته می شود. میتوکندری اندامکی است که وظیفه آن تبدیل انرژی موجود در مواد غذایی به نوعی از انرژی است که توسط سلول ها استفاده می شود.

به طور کلی، توالی DNA از 4 نوع نوکلئوتید ساخته شده است که شامل باز های آلی آدنین (A)، گوانین (G)، سیتوزین (C) و تیمین (T) می باشد. DNA انسان، متشکل از حدود 3 بیلیون باز است که حدود 99% این بازها در همه افراد یکسان می باشد. نکته مهمی که باعث تفاوت می شود توالی یا ترتیب قرار گیری این بازها در کنار یکدیگر است که می توانند کد کننده ترکیبات مختلفی در سلول باشند که از لحاظ حیاتی مهم است و به کمک روش توالی یابی شناسایی می گردد.

بازهای آلی در ساختار DNA می توانند با یکدیگر جفت شده و جفت باز تشکیل دهند که امر اساس دو رشته ای شدن رشته های DNA می باشد، به طوریکه باز آدنین (A) با باز تیمین (T) و باز گوانین (G) با باز سیتوزین (C) جفت می شوند. به ترکیب یک باز آلی به همراه قند و فسفات، نوکلئوتید گفته می شود که واحد سازنده ملکول DNA می باشد. این ماکرو مولکول به صورت ساختار مارپیچ دو رشته ای است که اطلاعات ژنتیکی لازم برای عملکرد و تکوین انسان و سایر ارگانیسم ها را حمل می کند. این ساختار شبیه نردبانی می باشد که پله های آن، از جفت بازهای مکمل هم و بدنه نردبان از ملکول های قند و فسفات تشکیل شده است.

ساختار اسید های نوکلئیک

برای درک بهتر روند انجام روش توالی یابی ، ابتدا به توضیح ساختار اسیدهای نوکلئیک می پردازیم، اسیدهای نوکلئیک بخش های اصلی تشکیل دهنده ساختار DNA هستند و دارای 3 جز می باشند که عبارتند از:

• باز آلی (A,T,G,C)

• یک ملکول قند پنج کربنه

• یک عدد فسفات

توجه به این نکته حائز اهمیت است که قندی که در ساختار DNA به کار رفته است از نوع دئوکسی ریبوز است، اما RNA از قند دیگری به نام ریبوز ساخته شده است.

ژن چیست؟

ژن ها، واحد فیزیکی و عملکردی وراثت می باشد که حاوی دستورالعمل های لازم برای ساخت پروتئین هستند. در پروژه ی ژنوم انسان که با هدف توالی یابی کل ژن ها انجام شد، حدود 20000 تا 25000 ژن شناسایی و توالی یابی گردید. به طور کلی هر فرد دارای دو نسخه از هر ژن است که یک نسخه از پدر و نسخه ی دیگر ار مادر به فرزندان منتقل می شود. اغلب توالی ژن ها در افراد مختلف یکسان است، اما گاهی بروز تغییرات در تولی بازهای آلی موجب ایجاد تفاوت و جهش های ژنتیکی می شود. 

جهش های ژنتیکی به راحتی با توالی یابی قابل تشخیص می باشند. ژن های کد کننده پروتئین از دو بخش مختلف به نام اگزون و اینترون تشکیل شده است. اینترون ها نواحی هستند که در زمان ویرایش RNA از توالی حذف شده و اگزون ها به هم متصل شده و جهت سنتز پروتئین مورد استفاده قرار می گیرد. هرگونه تغییر یا جهش در ساختار DNA منجر به تغییر توالی نوکلئوتیدها شده و اغلب بیماری های ژنتیکی در اثر بروز جهش در نواحی اگزونی ایجاد می شوند.

امروزه با استفاده از روش های مختلفی می توان DNA را توالی یابی یا سکانس نمود. هر موجود زنده دارای DNA منحصر به فرد است. توالی اسیدهای نوکلئیک در یک مولکول DNA مستقیما بر روی توالی اسید آمینه پروتئین ها و بدن افراد تأثیر می گذارد. جهش و تغییر در توالی DNA ممکن است سبب به وجود آمدن بیماری هایی مانند سرطان شود. در نتیجه روش های توالی یابی DNA، نقش مهمی در تشحیص انواع سرطان ها دارند. متداول ترین روشی که در تعیین توالی DNA مورد استفاده قرار می گیرد Sanger sequencing است. این روش در سال 1977، توسط فردریک سنگر و همکارانش ابداع شد و به همین دلیل تکنیک توالی یابی سنگر نام گرفت.

توالی یابی سنگر

روش توالی یابی سنگر بر اساس خاتمه یافتن سنتز زنجیره و استفاده از دی دئوکسی نوکلوئید ها ایجاد شده است. این تکنیک دارای مراحل مختلفی است که شامل:

1- آماده سازی توالی DNA الگو، جهت انجام PCR

در مرحله اول باید قطعه مد نظر جهت توالی یابی DNA به عنوان الگو PCR مورد استفاده قرار گیرد. در تکنیک توالی یابی سنگر از نوکلئوتید های دی دئوکسی نوکلئوتیدها (ddNTPs) استفاده می شود که اگر در زمان سنتز زنجیره در توالی DNA قرار بگیرند، سنتز خاتمه پیدا می کند. هر یک از ddNTP ها دارای رنگ فلوئورسنت اختصاصی هستند که از این طریق، توالی ها شناسایی می گردند.

2- جداسازی قطعات با ژل الکتروفورز

در مرحله بعد، به منظور توالی یابی DNA، قطعات ایجاد شده در PCR که اندازه های متفاوتی دارند، بوسیله الکتروفورز جداسازی می شوند. در تکنیک ژل الکتروفورز، DNA به ژل منتقل شده و توسط جریان الکتریسیته به حرکت در می آید. با توجه به اینکه ملکول های DNA به دلیل وجود گروه های فسفات در ساختار خود دارای بار منفی هستند، الیگونوکلئوتیدها به سمت الکترود مثبت در طرف مقابل ژل کشیده می شوند. از آنجایی که تمام قطعات DNA در واحد جرم دارای بار یکسانی هستند، سرعت حرکت الیگونوکلئوتیدها تنها بر اساس اندازه تعیین می شود. هرچه قطعه کوچکتر باشد، هنگام حرکت در ژل اصطکاک کمتری را تجربه کرده و سریعتر حرکت می کند. در نتیجه، الیگونوکلئوتیدها از کوتاه ترین توالی تا بلندترین توالی در ژل از بالا به پائین تفکیک می شوند.

در حال حاضر با پیشرفت تکنولوژی، لوله های موئینه جایگزین ژل شده است، زمانی که محصول PCR به ژل منتقل می شود، قطعات سنتز شده بر اساس طول قطعه از ژل عبور می کنند و خارج می شوند. بنابراین قطعاتی که کوتاه ترند سریع تر خارج خواهند شد، در قسمتی خروجی یک عدد لیزر وجود دارد که قادر به شناسایی رنگ های فلورسنت اختصاصی می باشد. هر یک از قطعات دارای یک نوع ddNTPs با یک رنگ منحصر به فرد هستند که تابش نور باعث ثبت آن رنگ در دستگاه ژنتیک آنالایزر می شود. به این ترتیب توالی DNA مدنظر مشخص خواهد شد.

3- تعیین توالی DNA با استفاده از آنالیز قطعات تفکیک شده

آخرین مرحله تعیین توالی قطعه DNA مدنظر با استفاده از اطلاعات بدست آمده از ژل الکتروفورز می باشد. امروزه دستگاه های توالی یابی سنگر از شرکت های مختلفی در بازارهای جهانی در دسترس هستند اما یکی از بهترین و مدرن ترین شرکت ها در زمینه ارائه تجهیزات و دستگاه های توالی یابی، شرکت ABI می باشد که سیستم های توالی یابی آن در ایران وجود دارد و آزمایشگاه ژنتیک مرکز باروری و درمان ناباروری مام دارای یکی از پیشرفته ترین دستگاه های سنگر با نام Genetic Analyzer 3500 است.