پرایمر چیست؟

پرایمرها قطعات الیگو نوکلئوتیدی هستند که معمولا اندازه آنها بین 18 تا 24 نوکلئوتید است و یکی از مهم ترین اجزای واکنش PCR برای تکثیر قطعه مورد نظر می باشند. این توالی های آغازگر باید قبل از سنتز توسط نرم افزارهای بیوانفورماتیکی طراحی شوند که اصطلاحا طراحی پرایمر نام دارد. به منظور درک بهتر از نحوه عملکرد و اهمیت پرایمرها، در ابتدا به توضیح فرایند PCR می پردازیم.

PCR چیست؟

این تکنیک در سال ۱۹۸۳ توسط کری مالیس ابداع و به کار گرفته شد و در حال حاضر روش PCR یا واکنش های زنجیره ای پلیمراز، به عنوان تکنیکی متداول و کاملا ضروری در تمام آزمایشگاه های مولکولی بالینی و پژوهشی مورد استفاده قرار می گیرد. روش PCR تحول عظیمی در علوم پزشکی و تشخیص بیماری ها، میکروبیولوژی و صنایع غذایی و همچنین تعیین هویت ژنتیکی و علوم جنایی ایجاد کرده است. در حقیقت میتوان PCR را روشی برای تکثیر ماده ژنتیکی در مقادیر بسیار بالا نامید که مبنای آن بر اساس چرخه های حرارتی تکرار شونده است. در ابتدا دو رشته ی DNA در اثر دمای بالا از هم جدا می شوند و به صورت تک رشته ای در می آیند. در مرحله بعد دما کاهش یافته و پرایمرها به توالی های هدف متصل می شوند. برای شناسایی، اتصال و تکثیر قطعه ی هدف به دو پرایمر نیاز است که پس از طراحی پرایمر سنتز می شوند و یکی به توالی هدف و دیگری به رشته مکمل آن متصل می‌شود. این دو پرایمر به ترتیب، پرایمر Forward یا پیشرو و پرایمر Reverse یا معکوس نام دارند و به صورت اختصاری با حروف F و R نمایش داده می شوند. پس از اتصال پرایمرها به نواحی مورد نظر، فرایند تکثیر در حضور آنزیم DNA پلیمراز آغاز می شود. 

نقش پرایمر در واکنش PCR چیست؟

پرايمرها، که آنها را توالی های آغازگر نیز می نامند، توالی هایی هستند که حضورشان در واکنش PCR برای شروع فرایند تکثیر ضروری است و دارای دو عملکرد ویژه هستند که شامل:

• شناسایی توالی هدف و اتصال به جایگاه مورد نظر، که این موضوع تنها با طراحی پرایمر به صورت اختصاصی امکان پذیر است. دقت و صحت نتایج آزمایش PCR ارتباط مستقیمی با کیفیت پرایمرهای طراحی شده دارد.

• طول قطعات مورد نظر برای تكثير نیز توسط پرایمر ها تعیین می شود، به این صورت که حد فاصل بین دو پرایمر (Forward, Reverse) به عنوان قطعه هدف در نظر گرفته می شود. در زمان طراحی پرایمر اندازه این قطعه مشخص شده و بر این اساس فرایند طراحی انجام می شود.

طراحی پرایمر چگونه انجام می شود؟

امروزه طراحی پرایمر به کمک نرم افزار های خاص بیوانفورماتیکی انجام می شود که استفاده از آنها این امکان را فراهم می کند که پارامترهایی مانند طول پرایمر، اندازه محصول PCR یا قطعه هدف، دمای ذوب، محتوای GC و موارد دیگر، به صورت تخصصی مورد بررسی قرار گیرد. به کارگیری مقادیر بهینه از هر یک از موارد فوق نقش مهمی در کیفیت نتایج PCR دارد که در ادامه به توضیح آن می پردازیم

طول پرایمر

طول بهینه پرایمر بین 18 تا 24 جفت باز است. پرایمرهایی که اندازه آنها بیشتر از این مقدار باشد، در مرحله اتصال به توالی هدف دچار مشکل می شوند و قطعه هدف به خوبی تکثیر نمی گردد. چنانچه اندازه پرایمرها کمتر از حد استاندارد باشد نیز موجب انصال در نواحی غیر اختصاصی شده و به همین علت محصول PCR غیر اختصاصی تولید می شود. 

طول محصول PCR

اندازه محصول PCR با توجه به نوع PCR و اندازه توالی هدف متغیر است و به طور میانگین بین 200 تا 1000 جفت باز متغیر است. اما باید این نکته را مد نظر داشت که تکثیر توالی های طویل، نیازمند آنزیم ها و شرایط خاص واکنش است. علاوه بر این در زمان طراحی پرایمر باید شرایط ژن هدف را برای خوانش بهینه در نظر گرفت، زیرا پرایمر یکی از اجزای ضروری در فرایند توالی یابی می باشد.

دمای ذوب پرایمر

دمای ذوب پرایمر (Tm) دمایی است که در آن نیمی از پرایمرها از DNA الگو جدا می شوند. دمای ذوب پرایمر ها معمولاً بین 50 تا 60 درجه سانتیگراد است. در زمان طراحی پرایمر باید توجه شود که اختلاف دمای ذوب بین پرایمرهای Forward و Reverse بیشتر از 3 درجه نباشد. نرم افزارهای طراحی پرایمر به صورت اتوماتیک دمای ذوب پرایمر را محاسبه می نمایند، با این حال محاسبه Tm پرایمرها با استفاده از فرمول زیر نیز امکان پذیر است :

Tm = 4 °C × (G+C) + 2 °C × (A+T)

G, C, A, T: تعداد نوکلئوبازها (گوانین، سیتوزین، آدنین، تیمین) در توالی پرایمر است. همانطور که در فرمول بالا نشان داده شده است، شکستن پیوندهای G-C سخت تر از پیوندهای A-T است، زیرا جفت های پایه G-C توسط سه پیوند هیدروژنی و جفت های پایه A-T توسط دو پیوند به هم متصل می شوند و طول پرایمر نیز بر دمای ذوب آن تأثیر می گذارد. این موضوع به این معنی است که اگر دمای ذوب پرایمر خیلی پایین است، با افزایش طول پرایمر می توان آن را تعدیل نمود. 

دمای اتصال یا annealing پرایمر (Ta)

Ta دمایی است که پرایمرها در این دما به DNA الگو متصل می شوند و باید در زمان طراحی پرایمر مد نظر قرار گیرد، دمای اتصال از طریق فرمول زیر محاسبه می گردد:

T_a Opt = 0.3 x (T_m of primer) + 0.7 x (T_m of product) – 14.9

Ta: دمای اتصال پرایمر

Tm (پرایمر): دمای ذوب پرایمر

Tm (محصول): دمای ذوب محصول PCR

لازم به توضیح است که پس از استفاده از نرم افزار برای طراحی پرایمر، بهتر است در هنگام انجام PCR دمای اتصال را با یک برنامه شیب دمایی (گرادیان) مورد بررسی قرار داد. 

مقدار GC

همانطور که قبلا نیز به این موضوع اشاره شد، اتصال جفت‌های باز G-C قوی‌تر از جفت‌های باز A-T هستند، به این معنی که محتوای GC بالاتر، اتصال پایدارتری بین پرایمرها و DNA الگو ایجاد می کند. میزان GC بهینه یک پرایمر بین 40 تا 60 درصد است و پرایمرها باید دو تا سه عدد G و C در انتهای 3' داشته باشند تا به طور اختصاصی به DNA الگو متصل شوند.

توالی های تکراری یا مکمل

قرارگیری چهار یا چند باز منفرد مانند ACCCCC یا تکرارهای دی نوکلئوتیدی (مثلا ATATATATAT) موجب بروز اختلال در PCR می گردد. به همین دلیل پرایمرها پس از طراحی باید در پایگاه های اطلاعاتی مانند NCBI مورد بررسی قرار گیرد تا از اختصاصیت آن اطمینان حاصل شود. غیر اختصاصی بودن پرایمر موجب می شود به توالی های مشابه اتصال پیدا کند و نواحی دیگری را تکثیر نماید.

ساختارهای ثانویه

ساختارهای ثانویه در پرایمرها ناشی از واکنش های بین مولکولی و درون مولکولی می باشند و موجب اختلال در عملکرد یکی از پرایمر ها و یا هر دو پرایمر می شوند، در نتیجه کیفیت محصول PCR را نیز تحت تاثیر قرار می دهند. ساختارهای ثانویه (پرایمر دایمر) انواع مختلفی دارند که شامل:

ساختار سنجاق سر(Hairpins): ناشی از همسانی درون مولکولی می باشد و زمانی اتقاق می افتد که ناحیه ای از سه یا چند باز مکمل در ناحیه دیگری از همان پرایمر وجود دارد 

پرایمر دایمر (Self Dimer, Cross Dimer) : زمانی تشکیل می‌شوند که دو پرایمر Forward و Reverse و یا هر یک از پرایمرها به تنهایی دارای توالی‌های مکمل و بر همکنش باشند. 

با توجه به تمامی مواردی که در مورد طراحی پرایمر به آن اشاره شد، در زمان طراحی باید تمام نکات فوق را مد نظر قرار داد و علاوه بر این باید پرایمرها طوری طراحی شوند که کاملا مکمل توالی هدف باشند و از سوی دیگر به هیچ بخش دیگری از مولکول الگو، متصل نشوند.غلظت بهینه پرایمرها برای واکنش PCR از 100 نانو مولار تا یک میکرو مولار متغیر است و در صورتی که بیشتر از این مقدار باشد منجر به تولید قطعات غیر اختصاصی می شود. 

خدمات طراحی و سنتز پرایمر

 در این مقاله به توضیح نکات کلیدی و مهم در طراحی پرایمر پرداختیم، اما باید توجه داشت که پس از طراحی، پرایمر ها باید توسط نرم افزار های تخصصی بررسی شوند تا صحت آنها تایید گردد. لازم به توضیح است در مرکز مام ژن، علاوه بر ارائه کلیه خدمات ژنتیک و انجام آزمایش ها، طراحی و سنتز پرایمر نیز توسط کارشناسان در کمترین زمان ممکن و با بهترین کیفیت انجام می شود.

برای دریافت مشاوره رایگان و کسب اطلاعات بیشتر، میتوانید سوال خود را از طریق بخش گفتگوی آنلاین و ارتباط با مشتریان در قسمت پایین صفحه (لوگوی MOMGENE) مطرح نموده و یا با شماره تلفن 42500-021 داخلی 562 تماس حاصل فرمایید.